Saturs
- posmi
- 1. metode Baktēriju identificē ar Gram traipu
- 2. metode Veiciet Ziehl-Neelsen krāsošanas testu
- 3. metode Izpētīt baktēriju izturēšanos un izskatu
- 4. metode Interpretē visus rezultātus
Baktēriju identificēšana ir sarežģīts uzdevums. Viens no iemesliem ir tāds, ka saskaņā ar aplēsēm pasaulē ir no 10 000 līdz 1 miljardam baktēriju sugu! Pareizi noteikt baktērijas ir ļoti svarīgi, īpaši medicīnas jomā, kur pareiza slimības ārstēšana lielā mērā ir atkarīga no mikrobu veida, kas rada problēmu. Vairumā gadījumu identifikācija tiek veikta, pamatojoties uz elimināciju. Lai identificētu baktēriju, jums jāveic krāsošanas testi, jāanalizē tās izskats un jānovēro, kā tā labi reaģē uz dažādiem apstākļiem. Ja jums nepieciešams ātrs rezultāts, paņemiet DNS paraugu, lai nosūtītu uz laboratoriju.
posmi
1. metode Baktēriju identificē ar Gram traipu
- noteikt ja baktērijas ir grampozitīvas vai negatīvas. Gram krāsošana ir metode baktēriju sadalīšanai starp diviem visizplatītākajiem veidiem: grampozitīvu un gramnegatīvu. Pirmajiem ir bieza šūnu siena, kas sastāv no polimēra, ko sauc par peptidoglikānu, un tas vislabāk izdalās kā gramnegatīvo baktēriju plānas sienas.
- Daži izplatīti grampozitīvo baktēriju veidi ir streptokoki, stafilokoki, mikrokoki (vai mikrokoki) un listerijas.
- Šeit ir daži izplatīti gramnegatīvo baktēriju piemēri: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium un Campylobacter.
- Veiciet atbilstošus aizsardzības pasākumus. Baktērijas un ķīmiskie elementi, kurus izmantosit testa laikā, rada risku jūsu veselībai. Veicot krāsošanas testu, valkājiet aizsargbrilles, vienreizējās lietošanas nitrila cimdus un laboratorijas mēteli. Kad esat pabeidzis, ielieciet cimdus un visus citus piesārņotos materiālus speciālā somā. Atcerieties ievērot laboratorijas procedūras, lai atbrīvotos no piesārņoto produktu maisiņa.
- Novietojiet novēroto paraugu uz stikla priekšmetstikla. Lai sāktu testu, uz sterila priekšmetstikla ievieto pilienu vai baktēriju paraugu. Pēc tam slīdiet asmeni virs Bunsena degļa, kas ir trīs reizes ieslēgts, lai fiksētu paraugu un novērstu tā iznākšanu no plāksnes, kad jūs skalojat vai pievienojat reaģentus.
- Pievienojiet asmenim 5 pilienus purpursarkanā kristāla. Paraugā ielej piecus pilienus kristālvioletā šķīduma. Pagaidiet minūti, līdz paraugs absorbē kristālvioletu.
- Turiet asmeni vietā ar drēbju tapām, lai jūs netērētu rokas.
- Rūpīgi nomazgājiet asmeni, lai notīrītu traipu. Izmantojiet krānu vai izspiestu pudeli un ļaujiet ūdenim darboties ļoti lēni līdz piecām sekundēm, lai noņemtu tintes atlikumus, kas nav pielipuši paraugam.
- Uz priekšmetstikla ielej piecus pilienus grammdiodes traipa. Tas ir šķīdums, kas sastāv no diodēm, nātrija bikarbonāta un kālija diodīda, kas izraisa kristālvioletā kušanu ar baktēriju šūnu sienām. Uz parauga ielej piecus pilienus šķīduma un atstāj uz vienu minūti.
- Nomazgājiet paraugu ar spirtu vai pienskābi. Alkohols un lacetons ir balināšanas līdzekļi un novērš baktēriju šūnu sienu iekrāsošanos, ja tie ir gramnegatīvi. Pārlejiet dažus pilienus balinātāja uz parauga un ļaujiet tam darboties ne ilgāk kā trīs sekundes. Pēc tam mēģiniet piecas sekundes viegli noskalot ar ūdeni, lai noņemtu šos balinātājus.
- Ja ļausiet balinātājam ilgstoši darboties, tas var izraisīt grampozitīvo baktēriju iekrāsošanās izzušanu, kā rezultātā rodas viltus negatīvs.
- Veiciet kontrasta pārbaudi ar safranīnu. Safranīns ir sarkana krāsa, kas kontrastē ar kristālvioleto, tādējādi krāsojot baktērijas, kuras neietekmē purpura krāsošana. Uz parauga ielej apmēram piecus pilienus safranīna un atstāj uz vienu minūti. Pēc tam mēģiniet piecas sekundes viegli noskalot ar ūdeni.
- Vizualizējiet savu paraugu ar 1000x palielinājumu. Baktērijas kļūs purpursarkanas vai purpursarkanas, ja tas ir grampozitīvs, vai rozā, ja tas ir gramnegatīvs safranīna dēļ.
2. metode Veiciet Ziehl-Neelsen krāsošanas testu
- Izmantojiet šo paņēmienu, lai noteiktu skābes nesošās baktērijas. Šīs sugas satur lielāku lipīdu daudzumu, padarot tās izturīgākas pret krāsvielām, kuras izmanto Gram krāsošanā. Skābēm izturīgās baktērijas pieder pie Mycobacterium ģints, kurā ietilpst baktērija, kas ir atbildīga par tuberkulozi (M. tuberculosis). Lai krāsotu skābēm izturīgu baktēriju, jums jāizmanto sarkana krāsa, ko sauc par karbolisko fuksīnu, izturīga pret skalošanu ar skābju vai sērskābes šķīdumiem.
- Veiciet atbilstošus aizsardzības pasākumus. Ķīmiskie un bioloģiskie materiāli, ko izmanto Zīles-Neelsenas krāsošanas laikā, var būt bīstami. Turklāt jums būs jāizmanto arī siltuma avoti, piemēram, Bunsen sprausla, elektriskais sildītājs vai spirta spuldze. Izpildiet tālāk sniegtos norādījumus, lai veiktu testu.
- Uzvelciet aizsargbrilles, nitrilcimdus un laboratorijas mēteli.
- Esiet piesardzīgs, lai neieelpotu krāsvielu un balinātāju tvaikus un neļaujiet pilieniņām izšļakstīt acis vai ādu. Turiet konteinerus atvērtus zem pārsega.
- Sildot asmeni, esiet ļoti uzmanīgs. Lielākā daļa izmantoto ķīmisko vielu ir viegli uzliesmojošas. Uz priekšmetstikliņiem vai cita aprīkojuma var būt arī viegli uzliesmojošu vielu pēdas.
- Sagatavojiet asmeni. Ar riņķveida kustībām sterila priekšmetstikliņa centrā vienmērīgi izlīdzina nelielu daudzumu baktēriju parauga. Jūsu paraugam vajadzētu būt apmēram 10 mm līdz 20 mm.
- Nosusiniet asmeni. Novietojiet asmeni uz žāvēšanas struktūras ar paraugu uz augšu. Ļaujiet tai dabiski nožūt 30 sekundes. Nemēģiniet nožūt asmeni ar lupatiņu.
- Nostipriniet paraugu ar karstumu. Kad paraugs ir uz augšu, divas vai trīs reizes slīdiet asmeni virs ieslēgta Bunsena degļa. Jūs varat arī novietot asmeni uz elektriskā sildītāja, vismaz divas stundas iestatot temperatūru no 65 ° C līdz 75 ° C. Esiet piesardzīgs, lai paraugu neuzvārītu un nedegtu.
- Pievienojiet asmenim karbolisko fuksīnu. Pārlejiet dažus pilienus šī šķīduma uz priekšmetstikliņa. Ielejiet pietiekami, lai paraugs būtu pilnībā pārklāts.
- Sildiet asmeni, lai fiksētu krāsvielu. Uzmanīgi uzsildiet priekšmetstikliņu virs Bunsen degļa vai spirta lampas ar paraugu uz augšu vai novietojiet to uz elektriskā sildītāja. Sildiet asmeni līdz 60 ° C vai līdz tas sāk izdalīt tvaiku. Ļaujiet krāsai iedarboties piecas minūtes.
- Ja jūs izmantojat elektrisko sildītāju, ieslēdziet to 60 ° C temperatūrā. Ja izvēlaties spirta lampu vai Bunsen degli, jums vajadzētu sagaidīt dūmu parādīšanos.
- Lai asmeni piecas minūtes uzturētu vēlamajā temperatūrā, to periodiski silda.
- Esiet piesardzīgs, lai paraugu nevārītu, nedegtu un neizžāvētu.
- Noskalojiet asmeni ar aukstu ūdeni. Ļaujiet tai atdzist piecas minūtes un dažas sekundes viegli noskalojiet ar tīru ūdeni. Izmantojiet krāna ūdeni vai izspiestu pudeli, lai noņemtu krāsošanas traipus, kas nav pielipuši paraugam.
- Ieliet uz parauga skābo spirtu vai sērskābi. Lai pilnībā pārklātu paraugu, izmantojiet 3 tilpuma% (tilp. / Tilp.) Spirta vai 20% sērskābes. Ļauj skābei darboties, līdz krāsa izbalē un sasniedz ļoti spilgti rozā nokrāsu. Parasti process ilgst apmēram desmit minūtes.
- Lai skalotu asmeni, izmantojiet tīru ūdeni. Viegli mazgājiet asmeni zem krāna vai, izmantojot izspiežamo pudeli. Labi noņemiet visus skābju un krāsvielu atlikumus.
- Pievienojiet kontrastvielu. Kad esat izskalojis priekšmetstikliņu, ielejiet to malahīta zaļā vai metilēnzilā krāsā. Šie divi risinājumi rada zilganu vai zaļganu fonu, uz kura parādīsies sarkanā krāsa, kā arī citus bioloģiskos materiālus, piemēram, cilvēka šūnas un baktērijas, kas nav izturīgas pret skābēm. Ļaujiet vielām darboties vienu līdz divas minūtes.
- Noskalojiet un nosusiniet asmeni. Rūpīgi noskalojiet ar ūdeni, lai noņemtu lieko kontrastu. Kad esat pabeidzis, nosusiniet asmeņa aizmuguri ar sausu drānu un ļaujiet tai dabiski nožūt uz statīva.
- Vizualizējiet savu paraugu ar 1000x palielinājumu. Skābēm izturīgās baktērijas kļūs sarkanas vai tumši rozā. Citas baktērijas, nebakteriālas šūnas un lāpstiņas pamatne kļūs zaļa vai zila.
3. metode Izpētīt baktēriju izturēšanos un izskatu
- Analizējiet baktēriju formu. Pēc krāsošanas testa veikšanas, lai noteiktu, vai baktērijas ir grampozitīvas, gramnegatīvas vai izturīgas pret skābēm, ir laiks precīzāk noteikt sugas. Vispirms analizējiet baktēriju formu priekšmetstiklā. Trīs visizplatītākās formas ir cocci (sfēriskas), spirāles un bacilli (stieņa forma).
- Ir vairāki šo formu varianti. Apaļas formas baktērijas (kokoss), piemēram, var parādīties pa pāriem (diplokoki), ķēdēs, kaudzēs vai četrās grupās (tetradi).
- Uzziniet, vai baktērijas ir aerobās vai anaerobās. Paņem divus baktēriju paraugus un izveido divas atsevišķas kultūras. Mēnesim jābūt anaerobo (audzē bez skābekļa), bet otram jābūt aerobam (audzē ar skābekli). Pirms novērojat augšanu, anaerobās kultūras vismaz 48 stundas uzglabā 35 ° C temperatūrā bez skābekļa.
- Ja baktērijas aug vidē, kurā nav skābekļa, bet nav pakļautas skābekļa iedarbībai, tas nozīmē, ka tās ir anaerobas.
- Lai arī tie attīstās skābekļa vidē, bet ne skābekļa trūkuma apstākļos, tie ir aerobi.
- Kad tie attīstās abās vidēs, mēs runājam par fakultatīvām anaerobām baktērijām.
- Veiciet kustīgumu. Baktērija ir mobila, ja tā var pārvietoties viena pati ar vienu vai vairākām flagella. Motilitātes pakāpei ir ļoti liela nozīme noteiktu baktēriju sugu identificēšanā. Ir vairāki kustīguma veidi, taču drošākais un salasāmākais veids ir puscietais līdzeklis.
- Izveidojiet kustīgumu testa kultūru. Sagatavojiet baktēriju kultūru kultūras buljonā. Izpildiet tālāk sniegtos norādījumus, lai pagatavotu buljonu pēc jūsu izvēles.
- Inokulējiet kultūru puscietā agarā, lai veiktu kustīgumu. Pārklājiet daļu buljona kultūras ar sterilu inokulācijas adatu. Uzmanīgi iestādiet adatu pusšķidrā daga mēģenē, piemēram, TTC lagar, ko esat sagatavojis testam. Adatai jāiet cauri 2/3 agara.
- Kad esat pabeidzis, uzmanīgi noņemiet adatu, uzmanot, lai nepārsniegtu inokulācijas zonas robežas.
- Inkubējiet mēģeni 30 ° C temperatūrā 48 stundas.
- Izlasiet testa rezultātu. Kustības testa agars, nonākot saskarē ar baktērijām, kļūs sarkans. Ja tie ir mobili, šī sarkana vai rozīga nokrāsa izplatīsies visā vielā. Pretējā gadījumā iekrāsošanās notiks tikai injekcijas vietā.
4. metode Interpretē visus rezultātus
- Apkopojiet savus komentārus. Lai zinātu baktēriju veidu, jums būs jāapkopo informācija, kas iegūta no kultūrām, krāsošanas testi un formu novērošana. Ja jūs pēta pacienta paraugus, viņu parādītie simptomi var arī palīdzēt noteikt piemērotu baktēriju veidu.
- Piemēram, ja testi parāda, ka baktērijas ir gramnegatīvas, anaerobas, nemotīvas un pacientam pamanāt tādus simptomus kā sāpes vēderā, slikta dūša un vemšana, iespējams, ka pacients cieš no Bacteroides infekcijas. fragilis.
- Sazinieties ar datu bāzi. Pasaulē ir tūkstošiem baktēriju sugu. Nav iespējams visu zināt no sirds. Jums, iespējams, vajadzēs meklēt klīnisko mikrobioloģijas grāmatu vai tiešsaistes datu bāzi, lai salīdzinātu testa rezultātus ar informāciju par baktēriju sugām.
- Ir lieliski tiešsaistes resursi baktēriju identificēšanai, taču lielākā daļa šo datu bāzu ir pieejamas angļu valodā, ieskaitot Patricbrc.org un GlobalRPh. Tomēr jūs joprojām varat atrast noderīgu informāciju INRA Starptautiskā mikrobu resursu centra vietnē.
- Veiciet ģenētisko pārbaudi, lai uzzinātu precīzas baktēriju sugas. Dažos gadījumos jums, iespējams, būs jāidentificē baktēriju sugas. Ātrākā un vienkāršākā metode ir veikt DNS testu. DNS testi ir noderīgi arī baktēriju identificēšanai, kas ir izturīgas pret tradicionālajām krāsošanas un kultūras formām. Mūsdienās DNS testi ar mikroorganismiem notiek ļoti ātri un var būt gatavi mazāk nekā divu stundu laikā.
- Ja jums nav piekļuves laboratorijai, kas veic mikroorganismu ģenētisko secību, nosūtiet baktēriju paraugu uz specializētu aģentūru.